3AT系统,酵母双杂交实验中的关键抑制剂

3AT系统：酵母双杂交实验中的关键抑制剂

随着生物技术的不断发展，酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）已成为研究蛋白质相互作用的重要工具。然而，在实验过程中，由于自激活现象的存在，往往会导致背景信号过高，影响实验结果的准确性。为了解决这个问题，3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）作为一种有效的抑制剂，被广泛应用于酵母双杂交实验中。

酵母双杂交技术是一种基于酵母细胞的蛋白质相互作用研究方法。该技术通过构建两个融合蛋白，分别与DNA结合域（DNA-binding domain, DBD）和激活域（activation domain, AD）融合，从而检测两个蛋白质之间是否发生相互作用。然而，由于某些蛋白质的DNA结合域或激活域本身就具有活性，导致自激活现象，从而影响实验结果的准确性。

自激活现象是指在没有配对蛋白质的情况下，DNA结合域或激活域与报告基因（reporter gene）结合，导致报告基因表达的现象。这种现象在酵母双杂交实验中较为常见，尤其是在使用某些蛋白质作为诱饵（bait）或猎物（prey）时。为了降低自激活现象的影响，研究人员通常会在筛选培养基中加入3-AT抑制剂。

3-AT是一种竞争性抑制剂，可以与DNA结合域或激活域结合，从而抑制其活性。在酵母双杂交实验中，加入适量的3-AT可以降低自激活现象，提高实验结果的准确性。此外，3-AT还可以用于筛选具有较高自激活活性的蛋白质，从而优化实验条件。

在使用3-AT抑制剂时，需要注意以下事项：

计算所需平板的数量，配置培养基体积。

设置3-AT的浓度梯度，建议10-50 mM的浓度范围设3-5个梯度，常用浓度约30 mM。

灭菌筛选培养基，待培养基冷却到55℃左右，加入3-AT母液，摇匀后倒板。

标记每个平板的3-AT浓度，超净台冷却凝胶后，按单位面积单个克隆计算培养物浓度，涂板。

28-30℃培养3-5天，筛选出最佳3-AT浓度，用于后期互作筛选。

3-AT溶液为经过过滤除菌的即用型母液，储存条件如下：

理想情况下，10 mM浓度的3-AT平板会有少量生长，20 mM浓度的3-AT不能或极少生长。

如果在80 mM浓度的3-AT平板上生长酵母，说明自激活活性太高，不能用于双杂交实验。

3-AT抑制剂在酵母双杂交实验中的应用具有广泛的前景。随着生物技术的不断发展，3-AT抑制剂有望在更多蛋白质相互作用研究中发挥重要作用。此外，3-AT抑制剂还可以与其他实验技术相结合，进一步提高蛋白质相互作用研究的准确性和效率。

3-AT抑制剂作为一种有效的自激活抑制剂，在酵母双杂交实验中具有重要作用。通过合理使用3-AT抑制剂，可以降低自激活现象，提高实验结果的准确性。随着生物技术的不断发展，3-AT抑制剂在蛋白质相互作用研究中的应用前景将更加广阔。